В 1964 году он перешел в Театр на Таганке. На сцене Таганки Золотухин сыграл множество разноплановых ролей, среди которых Ванг‑водонос (Добрый человек из Сезуана), Грушницкий (Герой нашего времени), Андрей Находка (Мать), Глебов (Дом на набережной), Григорий Отрепьев (Борис Годунов), Федор Фомич Кузькин (Живой), Живаго (Доктор Живаго), маркиз де Сад (Марат и маркиз де Сад).

В спектакле Пир во время чумы Золотухин сыграл сразу четыре роли - Герцога, Дона Гуана, Фауста и Мефистофеля.

В 1965 году Валерий Золотухин впервые снялся в кино, сыграв Петра Трофимова в историко‑приключенческом фильме Пакет. Роль Трофимова принесла актеру первую известность.

Большой зрительский успех имел фильм Хозяин тайги (1968), где актер сыграл участкового Сережкина. В этой картине Золотухин работал в паре со своим другом Владимиром Высоцким.

В 1971 году на экраны вышла музыкальная комедия о гражданской войне Бумбараш, в которой актер сыграл главную роль и исполнил песни на стихи Юлия Кима. Фильм принес Золотухину огромную популярность и стал на долгие годы его "визитной карточкой".

В этом же году он снялся во втором фильме трилогии, начатой Хозяином тайги -детективе Пропажа свидетеля.

Среди других фильмов 1970‑х годов с участием Золотухина - Берега (1973), Каждый день доктора Калинниковой (1973), Царевич Проша (1974), Сказ про то, как царь Петр Арапа женил (1976), третий фильм трилогии о Василии Сережкине Предварительное расследование (1978). В 1979 году вышел телесериал Маленькие трагедии, в котором Золотухин сыграл Моцарта.

В 1980‑е годы Валерий Золотухин продолжал активно сниматься в кино. Среди фильмов, вышедших в это время, ‑ Средь бела дня (1983), И вот пришел Бумбо (1984), Человек с аккордеоном (1985).

В 1990‑х годах Золотухин мало снимался в кино. В 2000‑е годы актер вновь стал появляться на кино‑ и телеэкранах. Начало положил сериал Участок (2003), в котором Золотухин, умело сочетая комические и драматические краски, сыграл старика по прозвищу Хали‑Гали. В фильмах Ночной дозор (2004) и Дневной дозор (2005) он сыграл роль старого вампира.

В 2005 году вышла экранизация романа Михаила Булгакова Мастер и Маргаритарежиссера Владимира Бортко, в которой Золотухин снялся в роли Босого.

В 2009 году вышел фильм Черная молния, в котором он сыграл роль изобретателя Перепелкина. В 2012 году актер снялся в фильме Бригада: Наследник - продолжении культового сериала 2002 года.

Всего за свою актерскую карьеру Валерий Золотухин снялся в более чем 80 фильмах.

Актер участвовал в озвучивании многих известных картин, среди которых 12 стульев, где он спел песню Там, среди пампасов за Остапа Бендера, фильм Иван Васильевич меняет профессию, где Золотухин спел песню Разговор со счастьем (Вдруг, как в сказке, скрипнула дверь…) за героя Леонида Куравлева Жоржа Милославского.

В 2003 году Золотухин стал художественным руководителем Молодежного театра Алтая в Барнауле. С июля 2011 года - директор и художественный руководитель Театра на Таганке. С октября 2012 года - директор Театра на Таганке. 5 марта 2013 года стало известно, что актер тяжело болен и находится в реанимации столичного Института рентгенорадиологии. Глава департамента культуры Москвы Сергей Капков подписал его заявление об уходе с поста директора театра на Таганке по состоянию здоровья, назначив вместо него Владимира Флейшера.

Золотухин - автор многих художественных и публицистических книг: Таганский дневник, Секрет Высоцкого, Дребезги, На Исток‑речушку, к детству моему, Банька‑по‑черному и других. В 2003 году в родном селе актера Быстрый Исток на перечисленные им средства был открыт храм Богородицы.

Валерий Золотухин - Народный артист РСФСР (1987).

Актер был дважды женат; со второй женой Тамарой он познакомился на съемках фильма Единственная, где она работала помощником режиссера. От первого брака с актрисой Ниной Шацкой у него родился сын Денис, который стал православным священником. От второго брака - сын Сергей, который был барабанщиком в рок‑группе Мертвые дельфины. В 2007 году Сергей Золотухин погиб.

В 2004 году у Валерия Золотухина родился сын Иван от актрисы Театра на Таганке Ирины Линдт.